苯甲酸鈉又稱安息香酸鈉,是廣泛應用于食品及碳酸飲料產(chǎn)業(yè)中的防腐劑。多年來世界上大多數(shù)國家一直允許用SB作為食品防腐劑,*大允許量在0.15~0.25wt%之間,在美國,SB的*大允許量為0.1wt%。隨著食品工業(yè)的發(fā)展,食品中使用防腐劑的現(xiàn)象十分普遍。過去曾認為SB對人體無毒,但*近的研究表明,其可造成人體組織器官或機能的損害,具有遺傳毒性,使染色體分裂出現(xiàn)異常,使染色體發(fā)生結(jié)構(gòu)畸變以致斷裂并且會產(chǎn)生肝硬化、肌肉損傷甚至致癌,Tsay等發(fā)現(xiàn)SB能使斑馬幼蟲發(fā)生畸變。長期飲用含有SB的碳酸飲料易使兒童產(chǎn)生多動癥。因此,苯甲酸鈉的生物安全性和對人體的危害程度必然要引起我們的重視。

將Balb/c系小鼠斷髓處死,在超凈臺內(nèi)無菌分離雙側(cè)腋窩、鎖骨下、腹股溝淺表淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié),PBS清洗,去除被膜,機械研磨,于200目不銹鋼網(wǎng)篩過濾。收集細胞,用4oCPBS1200r/min離心5min。洗滌細胞2次,重懸于RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%FBS及50μmol/Lβ-巰基乙醇),調(diào)整細胞密度為1×106/mL。臺盼藍染色觀察細胞活力,活細胞數(shù)占98%。添加SB溶液至淋巴細胞培養(yǎng)液中,終濃度分別為0wt%、0.05wt%、0.1wt%和0.2wt%。將細胞在24孔板接種后放置于37oC、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h、6h、12h、18h。

樣品制備分別取與不同濃度SB作用1h、6h、12h、18h后的淋巴細胞,滴于新剝離的云母片上,使其自然鋪展,吸附10min,然后用2.5%的戊二醛(日本京都產(chǎn))固定15min,用蒸餾水沖洗3次,室溫自然干燥。

原子力顯微鏡成像將制備好的樣品置于afm原子力顯微鏡的XY掃描臺上,用監(jiān)視器定位所要掃描的樣品區(qū)域,在空氣中室溫下利用接觸或非接觸模式成像。原子力顯微鏡圖像僅經(jīng)過自帶軟件(IP2.1版)的平滑處理,以消除掃描方向上的低頻背景噪音。

實驗結(jié)果經(jīng)afm原子力顯微鏡掃描成像,獲得了正常淋巴細胞、與不同濃度SB作用不同時間后的淋巴細胞的拓撲形貌圖和誤差信號圖,并分別對其表面超微結(jié)構(gòu)進行了掃描分析,觀察細胞數(shù)超過30個。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),上述3種淋巴細胞均呈不同程度的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。正常淋巴細胞呈較為規(guī)則的圓形,中間隆起,細胞表面總體較為平滑,高度在1.8~2.5μm之間,直徑約為8~10μm。而與不同濃度SB作用后的淋巴細胞體積明顯發(fā)生變化。高度減少,細胞表面形態(tài)結(jié)構(gòu)更為復雜,中間部位出現(xiàn)明顯破裂并且凹陷,呈“Y”型結(jié)構(gòu),邊緣能觀察到有細微損傷分布,并且隨著SB濃度的增加,細胞形態(tài)進一步發(fā)生改變,呈中間凹陷狀,細胞邊緣向四周扁平鋪展。細胞表面球狀顆粒進一步增多,表面粗糙度增大,細胞高度明顯減少,直徑增加。對其局部小范圍進行觀察,原子力顯微鏡能清楚地觀察到細胞膜密集的顆粒狀突起物以及大量的孔洞,其中凹凸不平的細胞表面分布著大量小顆粒。選取不同細胞膜超微結(jié)構(gòu)圖的整個區(qū)域進行測量,與SB作用后淋巴細胞的四個參數(shù)值均明顯與正常淋巴細胞不同;對淋巴細胞膜形成的大小不一的顆粒進行統(tǒng)計,經(jīng)SB作用后的淋巴細胞膜形成的顆粒逐漸增大。同時,隨著與SB作用時間的延長,淋巴細胞出現(xiàn)的變化與上述情況類似,即作用時間越長,細胞損傷越嚴重,淋巴細胞的表面粗糙度也逐漸增加。

afm原子力顯微鏡是樣品表面信息的收集工具,較易獲得細胞的形貌、超微結(jié)構(gòu)及其生化反應后細胞形態(tài)變化等信息,是研究細胞損傷的有力工具。淋巴細胞是機體MIAN疫應答功能的重要細胞成分,其形態(tài)結(jié)構(gòu)與其功能息息相關。因此利用原子力顯微鏡研究淋巴細胞與外界環(huán)境相互作用前后細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及其細胞膜的變化,對了解淋巴細胞的生理功能具有十分重要的意義。